בארגון ההגנה ובהקמת צה"ל

עוד בצעדיו המוקדמים של אשכול בפעילות הציבורית בארץ ישראל נקשר שמו בגופי הביטחון של היישוב. במהלך 1921 היה חבר ועדת ההגנה של ההסתדרות ונתמנה כחבר במפקד הארצית הראשונה של ארגון ההגנה, תפקיד בו שימש כשנה ובמהלכה יצא בשליחות רכש לאוסטריה עם אליהו גולומב ודוד הכהן. לאורך שני העשורים הבאים, בתכניות ההתיישבות שיזם ודאג לפעול לתקצובם (דוגמת התיישבויות האלף, ותכנית חומה ומגדל) תרם אשכול לעיצוב גבולות ההגנה של היישוב היהודי בארץ ישראל. בקונגרסים הציוניים בהם השתתף קידם את תקצוב ההתיישבות על היבטיה השונים בקביעת ביזור היישובים ותרומתם לפיתוח הכלכלה והביטחון.

מלחמת העולם השנייה והמאבק בממשלת המנדט

בשנים 1939-1938 פעל רבות בארצות הברית למען המפדה הציוני ועם שובו לארץ, ביולי 1940 הוכנס בשנית למפקדה הארצית של ארגון ההגנה והיה חבר בה עד 1948, תקופה בחלקה שימש גם כגזבר הארגון. בתקופת מלחמת העולם השנייה היה מן התומכים הבולטים בעמדה המצדדת בהתגייסות לשורות הצבא הבריטי. על אף מעורבותו בפעולות להגברת שיעורי הגיוס, כעבור זמן הצטרף לעמדתו של דוד בן-גוריון לפיה הגיוס לא הניב תרומה מדינית למטרותיהם של אנשי היישוב והתנועה הציונית וכי יש לחזור ולחדש את המאבק במדיניות הבריטית בארץ ישראל.

במהלך 1946-1945, בכל חודשי פעילותה היה חבר ועדת X שתחתיה אוגדו שלוש המחתרות לשיתוף פעולה במאבק המזוין נגד הבריטים. בתקופה זו ביקש לאמץ גישה התומכת במאבק המזוין בצד המשך המשא ומתן המדיני. מאוחר יותר, לאחר החלטת הסוכנות היהודית לנקוט במדיניות הבלגה, ביקש להחליף את פעולות ההתנגדות המזוינת בפעולות העפלה והתיישבות. כך, באוגוסט 1946 הוביל החלטה להקמתם של יישובים חדשים בגליל, בנגב ובקרבת ירושלים. החלטות אלו גובו בתמיכה תשתיתית שסיפק מתוקף תפקידו במקורות.

כינון צבא העם בצל מלחמה

ב-1947, עם הידיעה על סיומו הקרב של המנדט הבריטי קרא להקמת מיליציה יהודית שאינה מחתרתית. ביוני 1947 מונה לחבר ועד הביטחון של היישוב ובשלהי אותה שנה החל לעמוד בראש מרכז המיפקד לשירות הציבור, מרכז שיועד להניח את התשתית לקראת גיוס המוני; עד מאי 1948 טופלו במרכז כ-110 אלף מועמדים לגיוס ומהם גויסו בפועל כארבעים אלף. בתקופה זו נתמנה לחבר ועדת הנגב ובמסגרתה היה מעורב בהכנת ההגנה על יישובי האזור לקראת מלחמת העצמאות.

בעקבות ביזור סמכויותיה של המפקדה הארצית של ארגון ההגנה, אשכול נתמנה על ידי דוד בן-גוריון בינואר 1948 לעוזרו האישי במחלקת הביטחון של הסוכנות היהודית. בתפקידו היה אמון על המגזר האזרחי: עד להקמת המדינה במאי 1948 המשיך לעסוק בתחום הגיוס ובניהול המרכז למיפקד ולאחר מכן הועבר לעסוק בנושאי רכש, תחבורה, אספקה והגנה אזרחית.

לאחר הקמתם של הממשלה הזמנית ושל משרד הביטחון, המשיך בתפקידו כעוזר שר הביטחון ושימש בפועל כמנהל הכללי של המשרד. חלק ניכר מזמנו הוקדש לתחום הרכש ולפיתוח התעשיות הביטחוניות במדינה, זאת נוסף על מעורבותו במשא ומתן לפירוק ארגוני המחתרת והחל ביולי 1948 בתפקידו כיושב ראש ועדה לייעול המנגנון הצבאי. מתוקף תפקידו במקורות, במהלך ההפוגה בקרבות מלחמת העצמאות קידם את הנחת צינור המים החדש לירושלים.

בינואר 1949 עזב אשכול את משרד הביטחון והתמסר לתפקידיו בסוכנות היהודית ובחברת מקורות.